临床研究新生血管性青光眼患者房水和血
▲ 采用前瞻性病例对照研究方法，纳入年5月至年3医院眼科确诊为NVG的患者8例8眼和POAG患者10例10眼，同期纳入ARC患者10例10眼。其中NVG组男5例，女3例，平均年龄（62.6±3.2）岁，纳入标准为经裂隙灯显微镜、前房角镜检查可见虹膜新生血管、眼压21mmHg（1mmHg=0.kPa），排除既往接受过抗VEGF药物注射、引流阀植入术、全视网膜光凝术等治疗的患者。POAG组患者男4例，女6例，平均年龄（61.2±4.1）岁，眼压21mmHg，伴视野缺损和视盘损害。ARC组患者男5例，女5例，平均年龄（63.9±3.5）岁，眼压为10～21mmHg。排除曾接受过抗VEGF药物注射、全视网膜光凝术、眼内激光光凝术、肿瘤及年龄相关性黄斑变性者。本医院伦理委员会批准（批文号：092），所有患者均签署知情同意书。3个组间患者性别、年龄的差异均无统计学意义（均P0.05）（表1）。
注：NVG：新生血管性青光眼；POAG：原发性开角型青光眼；ARC：年龄相关性白内障（a：Fisher精确概率法；b：单因素方差分析）
1.2方法
1.2.1标本采集
（1）血浆采集：术前1d抽取所有患者静息状态下空腹肘静脉血3~4ml，置于5ml乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）真空采血管，离心半径16cm，4℃r/min离心15min，取上清液0.3~0.4ml，置入1.5ml灭菌Eppendof离心管中，-80℃保存。
（2）房水采集：进入手术室后患者取仰卧位，手术眼常规眼部消毒、铺巾，开睑器开睑，用带有25G针头的注射器在角膜缘内1mm处行前房穿刺，抽取房水0.1~0.2ml，置入1.5ml灭菌Eppendof离心管中，-80℃保存。
1.2.2血浆和房水中细胞因子的检测
主要试剂为人VEGFELISA试剂盒、人TGF-β1ELISA试剂盒、人IL-6定量酶联检测试剂盒(美国RDSystems有限公司)。采用双抗体夹心ELISA法测定患者血浆和房水中VEGF、TGF-β1、IL-6质量浓度。建立ELISA标准曲线，待测品孔中每孔各加入待测样品μl，设2个复孔，室温下反应min，洗板4~6次，每孔中加入一抗工作液，反应板充分混匀后置室温孵育60min，洗板4~6次。添加酶标二抗工作液，反应板室温下孵育60min，洗板，加入底物液，室温避光反应5~10min。加入终止液混匀，用酶标仪（芬兰Thermo公司）测定波长为nm处的吸光度（A）值。
1.3统计学方法
采用SPSS20.0（SPSSInc.,Chicago,IL,USA）统计学软件进行统计学分析。本研究中测量指标的数据资料经W检验呈正态分布，以`x±s表示，组间均数经Levene检验证实方差齐。采用均衡分组三水平试验设计，NVG组、POAG组和ARC组患者房水和血浆中VEGF、TGF-β1、IL-6质量浓度的总体差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。患者房水和血浆中VEGF、TGF-β1、IL-6质量浓度变化的关系评估采用Pearson直线相关分析，并对相关系数进行t检验。P0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组患者房水和血浆中VEGF质量浓度的比较
NVG组、POAG组和ARC组房水中VEGF质量浓度分别为（.85±.88）、（.12±58.59）和（.88±12.35）pg/ml，血浆中VEGF质量浓度分别为（.93±95.20）、（.28±24.44）和（.82±31.91）pg/ml，各组间患者房水和血浆中VEGF质量浓度的总体比较差异均有统计学意义（房水：F=.80，P0.01；血浆：F=.84，P0.01），其中NVG组患者房水与血浆中VEGF质量浓度明显高于POAG组和ARC组，差异均有统计学意义（均P0.01），POAG组患者房水和血浆中VEGF质量浓度稍高于ARC组，但差异无统计学意义（P0.05）（图1）。
2.2各组患者房水和血浆中TGF-β1质量浓度的比较
NVG组、POAG组和ARC组房水中TGF-β1质量浓度分别为（.94±.00）、（54.48±35.58）和（47.98±17.69）pg/ml，血浆中TGF-β1质量浓度分别为（.78±.00）、（6.13±.39）和（.28±.27）pg/ml，3个组患者房水和血浆中TGF-β1质量浓度的总体比较差异均有统计学意义（房水：F=7.88，P0.01；血浆：F=4.18，P0.05），其中NVG组患者房水中TGF-β1质量浓度明显高于POAG组和ARC组，差异均有统计学意义（均P0.01），POAG组患者房水中TGF-β1质量浓度高于ARC组，但差异无统计学意义（P0.05）；NVG组患者血浆中TGF-β1质量浓度高于POAG组和ARC组，差异均有统计学意义（均P0.05），POAG组患者血浆中TGF-β1质量浓度高于ARC组，但差异无统计学意义（P0.05）（图1）。
2.3各组患者房水和血浆中IL-6质量浓度的比较
NVG组、POAG组和ARC组房水中IL-6质量浓度分别为（.87±41.64）、（38.97±19.06）和（29.48±14.61）pg/ml，血浆中IL-6质量浓度分别为（26.97±8.19）、（19.54±5.11）和（18.50±3.57）pg/ml，3个组患者房水及血浆中IL-6质量浓度明显不同，组间总体比较差异均有统计学意义（房水：F=.27，P0.01；血浆：F=5.59，P0.05），其中NVG组患者房水中IL-6质量浓度明显高于POAG组和ARC组，差异均有统计学意义（均P0.01），POAG组患者房水中IL-6质量浓度高于ARC组，但差异无统计学意义（P0.05）；NVG组患者血浆中IL-6质量浓度明显高于POAG组和ARC组，差异均有统计学意义（P0.05；P0.01），POAG组患者血浆中IL-6质量浓度高于ARC组，但差异无统计学意义（P0.05）（图1）。
图1各组患者房水与血浆中VEGF、TGF-β1和IL-6水平比较VEGF：房水：F=.80，P0.01；血浆：F=.84，P0.01.TGF-β1：房水：F=7.88，P0.01；血浆：F=4.18，P0.05.IL-6：房水：F=.27，P0.01；血浆：F=5.59，P0.05.与各自的NVG组比较，aP0.01，bP0.05（单因素方差分析，LSD-t检验）VEGF：血管内皮生长因子；TGF：转化生长因子；IL：白细胞介素；NVG：新生血管性青光眼；POAG：原发性开角型青光眼；ARC：年龄相关性白内障
2.4患者房水与血浆中VEGF、TGF-β1、IL-6质量浓度变化的关系
各组患者房水中VEGF质量浓度与血浆中VEGF质量浓度无明显相关性（NVG组：r=-0.，POAG组：r=0.，ARC组：r=-0.，均P0.05）；各组患者房水中TGF-β1质量浓度与血浆中TGF-β1质量浓度无明显相关性（TGF-β1：NVG组：r=0.；POAG组：r=0.；ARC组：r=0.，均P0.05）；各组患者房水中IL-6质量浓度与血浆中IL-6质量浓度无明显相关性（NVG组：r=-0.；POAG组：r=0.；ARC组：r=-0.，均P0.05）（图2）。
图2各组患者房水中VEGF、TGF-β1、IL-6质量浓度与血浆中VEGF、TGF-β1和IL-6质量浓度的关系A：房水中VEGF质量浓度与血浆中VEGF质量浓度的关系（r=-0.、0.、-0.，均P0.05）B：房水中TGF-β1质量浓度与血浆中TGF-β1质量浓度的关系（r=0.、0.、0.，均P0.05）C：房水中IL-6质量浓度与血浆中IL-6质量浓度的关系（r=-0.、0.、-0.，均P0.05）（Pearson直线相关分析，n=28）VEGF：血管内皮生长因子；TGF：转化生长因子；IL：白细胞介素；NVG：新生血管性青光眼；POAG：原发性开角型青光眼；ARC：年龄相关性白内障
3讨论
NVG是难治性青光眼，发病机制尚未完全阐明，多种细胞因子的共同作用导致虹膜和房角的新生血管形成[9]。VEGF是血管内皮细胞特异性血小板源性肝素结合生长因子，可特异性地刺激血管内皮细胞增生，进而形成新生血管[10]，是迄今最直接的、功能最强的、唯一具有促血管增生并增强血管通透性功能的促血管生长因子[11]，是公认的血管生成过程中的中心调节因素[12]。研究表明，NVG及其原发病变患者房水和玻璃体中的VEGF含量明显升高[13-15]。本研究中发现，NVG组患者房水和血浆中VEGF质量浓度明显高于POAG组及ARC组，与Iwabe等[14]、万新顺等[15]的研究结果吻合，进一步证实局部组织中VEGF水平升高与NVG患者新生血管的形成有关。诱导VEGF高表达的因素主要包括缺氧及缺氧诱导因子、转录因子AP-1、雌激素、环氧合酶2、神经因子、前列腺素E2、癌基因Ras和Src的产物及IL-6等[16-18]。在缺氧刺激下，正常的缺氧感受基因被激活，视网膜VEGFmRNA表达及其活性增加[17]，进而导致眼内VEGF质量浓度升高[19]，VEGF受体与VEGF亲和力不变，而VEGF受体数量增加50％[20]，表明VEGF在与缺氧相关的眼内新生血管形成过程中发挥重要作用。研究表明，新生血管出现前VEGFmRNA及其蛋白表达水平均升高，而在新生血管消退后其表达水平下降，并且新生血管的发生部位多邻近于VEGF的高表达区[21]。眼内注射抗VEGF药物可以迅速减少新生血管[22-24]，使已形成的虹膜新生血管消退[25-27]，部分患者抗VEGF药物治疗后眼压降低，角膜恢复透明[28-31]。研究表明，前房注射bevacizumab等抗VEGF药物可有效降低房水中VEGF质量浓度及虹膜新生血管化程度[32-35]，前房注射ranizumab对角膜内皮无明显损伤[36]，且房水中VEGF水平与眼压存在明显正相关[24]。NVG患者滤过性手术前行前房注射bevacizumab能够有效减少术后虹膜新生血管、降低眼压，减少术中和术后出血，减少手术并发症[37]。
TGF-β是一类具有多种功能的多肽类生长因子，在细胞的生长、分化、凋亡及免疫调节、细胞外基质的合成、贮存、胚胎发育、创伤修复等生物学活动中发挥重要功能。本研究中发现NVG组患者房水和血浆中TGF-β1质量浓度明显高于POAG组及ARC组，与Yu等[7]和郭斌等[38]的研究结果近似。此外，Prendes等[39]研究发现，TGF-β在青光眼的进展过程中发挥了主要作用，可作用于小梁网，导致房水流出减少，进而直接导致眼压升高，因此TGF-β通路有望成为新的青光眼替代治疗的靶点。
IL-6是趋化因子家族的一种细胞因子，具有促进血细胞发育、生长和分化、参与炎症反应等功能。Chen等[6]发现房水中IL-6水平与虹膜新生血管化间存在正相关，虹膜新生血管化时患者房水中IL-6水平升高，在新生血管消退后其水平降低，而在血浆中其变化甚微，这说明IL-6可能以某种方式与其他新生血管因子共同参与NVG的虹膜新生血管化进程。本研究中发现NVG组患者房水中IL-6质量浓度明显高于POAG组及ARC组，而POAG组与ARC组患者房水中IL-6水平无明显不同，且NVG组患者血浆中IL-6质量浓度明显高于POAG组和ARC，与CRVO继发虹膜新生血管患者房水中检测到IL-6水平变化的结果相一致[40]，同时也表明IL-6可能以某种方式与其他血管生长因子共同作用，从而参与NVG患者的NVI过程，可能是NVI发生和发展的一个预测因子[6]。Motor等[41]也发现，在毛细血管形成过程中IL-6mRNA表达峰，血管生成结束后IL-6mRNA检测不到。IL-6等炎症因子同样可以由低氧刺激诱导表达，具有与VEGF类似的特征，也可作为新生血管因子促进新生血管的生成[42]。本研究中进一步证实，IL-6可参与NVG患者虹膜新生血管生成的过程，可能与新生血管免疫球蛋白的形成有关。
综上所述，本研究中发现NVG组患者房水和血浆中VEGF、TGF-β1和IL-6质量浓度均明显高于ARC组，且3种细胞因子的质量浓度间无显著相关性，一定程度上说明3种细胞因子均参与NVG的发病过程，提示NVG可能是新生血管形成、炎症过程及免疫反应等共同作用的结果，抗TGF-β1、IL-6治疗可能有助于NVG的治疗。但本研究中收集的病例数量较少，未对NVG组进行原发病亚组分析，研究结果难免存在一定的偏倚，有待大样本量的研究进一步验证。
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